Orbitální třepačka je v praxi velmi jednoduché zařízení. Uživatel upevní baňky s médiem, nastaví teplotu a otáčky, které mu poradil jeho předchůdce, než odešel do důchodu a po stejně zděděné době třepání je hotovo. Funguje to tak 10–20 let, tak proč to teď měnit?
Dříve lidé tlačili pluh na svých polích a vše obdělávali ručně. Taky to fungovalo. Vzít tehdejšího sedláka do kabiny moderního traktoru John Deere, asi by se pokřižoval a začal utíkat před složitostí ovládání tlačíky, páčky, dotykovými displeji a pedály. V klidnějším provedení se s něčím podobným u některých uživatelů orbitálních třepaček setkávám i dnes.
Pokud čtete tento článek, asi přechod z třepačky k fermentoru zvažujete. Pojďme si nejprve shrnout fakta.
Důležité je si porovnat poměr mezi náročností a výsledky. Fermentor vychází téměř vždy lépe, než je tomu u třepačky. Tento článek si klade za cíl ukázat, jak vypadají vstupy pro toto posouzení - náročnost přípravy od rozbalení krabice s fermentorem až do spuštění první fermentace. Výstupy se budou lišit, podle typu zpracovávaného produktu. Pokud se na nás obrátíte, zkusíme s výrobcem najít ukázkový příklad právě pro vaši aplikaci.
Vybalení a sestavní bioreaktoru by měl vždy zajistit dodavatel. Naproti tomu není na škodu, když uživatel má podvědomí o tom, co vlastně přístroj pro svou funkci potřebuje. V tomto článku si vezmeme za příklad model Minifors, který je navržen právě s ohledem na uživatele přecházející z orbitálních třepaček k opravdové fermentaci. V našem případě budeme počítat s fermentací bakterií (např. E.Coli). Uživatelé se zájmem o fermentaci tkáňových kultur (hmyzí, savčí nebo rostlinné buňky) se na nás mohou obrátit a my jim rádi informace doplníme.
Je dobré je chtít od dodavatele, ještě před samotnou koupí přístroje. Pečlivý prodejce se nebude zdráhat k vám vyslat servisního technika, který provede obhlídku místa instalace a bude s vámi konzultovat přípravu.
Bioreaktory jsou ideální pro anaerobní kultivace - namísto vzduchu je potřeba napojení na inertní plyn (dusík nebo CO2).
Abychom v bioreaktoru zajistili sterilní podmínky, je potřeba kultivační nádobu nejprve sterilizovat. Ostatně doposud jste patrně podobný postup používali u baněk určených do třepačky. Do autoklávu ovšem přijde celá kultivační nádoba včetně hlav peristaltických pumpiček, regenčních lahviček s kyselinou / zásadou a samozřejmě také sondy pH a případně pO2.
Nyní je dobrá chvíle pro shlédnutí videa o přípravě Miniforsu pro první fermentaci. Celý následný text tak bude lépe pochopitelný.
Kalibrace pH sondy
Kalibrace pH se provádí stejně jako u jakéhokoliv obyčejného pH metru. Ideálně použijeme 2-bodovou kalibraci za použití roztoků s nízkým a vysokým pH faktorem.
Obdobným způsobem můžeme kalibrovat i pO2 sondu. Samozřejmě, na místo roztoků s vysokým a nízkým pH použijeme kyslík / dusík nebo vzduch v případě jednobodové kalibrace. Nesmíme zapomenout do kyslíkové sondy doplnit elektrolyt.
Osazení kultivační nádoby
Když máme sondy připravené, můžeme je umístit do kultivační nádoby. V případě modelu Minifors je víko navrženo tak, aby jednotlivé prvky nebylo možné zapojit špatně. Kromě sond bude třeba víko doplnit o inokulační ventil pro pozdější očkování média, průchodku pro přidávání kyseliny / zásady (případně antifoam), Exit Gas Cooler a samozřejmě průchodku pro odběr vzorků. Před vložením poslední součásti je samozřejmě nutné port použít pro naplnění kultivační nádoby médiem na úroveň pracovního objemu, pokud jste tak neučinili předtím.
Nyní stačí připojit reagenční lahvičky. Pro regulaci pH většina uživatelů používá pouze kyselinu nebo zásadu, protože fermentovaný produkt zpravidla potřebuje upravovat pH pouze jedním směrem.
Tip: Přípravu a samotnou sterilizaci kultivační nádoby podrobně rozebíráme v článku Sterilizace kultivační nádoby bioreaktoru.
Po vyjmutí nádoby z autoklávu ji připojíme zpět k fermentoru a odstraníme alu fólie, kterými jsme obalili všechny periferní přípojky. Můžeme už připojit pH a pO2 sondy, pt-100 teplotní sondu, přívod plynů a samozřejmě nasadit plastové hlavy pumpiček na hřídele - pozor na záměnu kyseliny a zásady! Nyní je také dobré již spusti program IRIS, který bude zaznamenávat nastavené a skutečné hodnoty.
Minifors reguluje teplotu pomocí alu bloku a tak rovnou můžeme aktivovat nastavení teploty a nastavit požadovanou hodnotu. Stejně tak nic nebrání aktivaci parametru pH. Aby oba zmíněné parametry fungovali, je nutné zapnout míchání.
Zatímco orbitální třepačky pracují běžně rozsahu 150 - 250 RPM, u bioreaktoru se počítá s diametrálně odlišnými hodnotami. Nejde totiž už o třepání, ale o míchání pomocí rushtonových lopatek. Nelze přesně říci, jakou hodnotu máte nastavit, pokud jste u třepačky používali XXX RPM.
Většina bakteriálních fermentací se pohybuje v rozmezí 300 - 1500 RPM, kde záleží na faktorech jako velikost kultivační nádoby, typ plynu pro okysličování apod.
Nejste-li si jisti nastavením správných parametrů pro vaši fermentaci, neváhejte se na nás obrátit nebo se podívejte do download centra INFORS HT.
V praxi má očkování fermentoru mnoho podob. U fermentací s nízkým rizikem kontaminace (streptokoky) jsem viděl uživatele jednoduše odšroubovat záslepku na víku a vsříknout inokulum do nádoby. Není to zrovna postup podle GMP, ale někomu to může stačit.
Dlouhá léta byla standardem metoda s použitím alkoholu a hořáku. Do inokulačního portu stačilo nakapat několik kapiček alkoholu na silikonovou membránu, zapálit a propíchnout inokulační jehlou. Opět z praxe vím, že řada uživatelů tuto metodu provozuje bez ohně a dokonce i opakovaně používá jednorázovou membránu.
Další možnou metodou je využití volné peristaltické pumpičky k přečerpání inokula z lahvičky do bioreaktoru. Standardem spíše u větších bioreaktorů je tzv. push-valve, který se sterilizuje zvlášť v autoklávu, ale samotné očkování pak spočívá pouze v otočení závitu.
Po očkování je potřeba akorát program IRIS jedním kliknutím přepnout do režimu fermentace - tím se aktivuje zobrazování alarmových hlášek a oddělený záznam procesu.
Není pravda, že by bylo nutné u bioreaktoru držet neustálý dohled a sledovat, co se děje. Fermentor jenom sleduje mnohem více parametrů oproti orbitální třepačce. Vše navíc zaznamenává program IRIS, který sice není nutný pro průběh fermentace, ale neznám uživatele, který by jej nepoužíval.
Proti orbitální třepačce lze navíc bioreaktor naučit předem daným procedurám při nastalých situacích. Nejedná se o recept, ale tzv. kontrolní sekvence. Ty se sepisují formou programovacího jazyka fungují asi takto:
Jde vlastně o jednoduchou kaskádu pro případ nedostatečného okysličování. Když bioreaktor zjistí míru okysličování pod 40%, nejprve zvýší otáčky o 20%, poté počká 2 minuty. Pokud to nezabere, zkusí přidat na průtoku vzduchu 10% a opět počkat, tentokrát 4 minuty. Jako poslední záchrana se akvituje kyslíkový ventil a začne přidávat do kultivační nádoby spolu se vzduchem čistý kyslík. Možnosti kontrolních sekvencí jsou de facto neomezené.
Odebrat vzorek z bioreaktoru není tak jednoduché, jako vyjmou baňku ze třepačky, to je pravda. Nicméně zase si lze zvolit odebíraný objem a proceduru často opakovat. V případě přístrojů INFORS HT mají uživatelé výhodu systému Super Safe Sampler, který umožňuje odebrat vzorek sterilně ve 3 jednoduchých krocích.
Stručně jsme si sepsali proceduru fermentace. Bioreaktor zpravidla nabídne mnohonásobně vyšší výtěžnost, než kterákoliv orbitální třepačka. Umožňuje nám také kultivaci vypilovat díky sledování a záznamu řady parametrů (zejména vzdušnění), zatímco často v praxi moc netušíme, co se v orbitální třepačce opravdu děje.
Fermentor ani nemusí být dražší, než inkubovaná třepačka. Dobře vybavený Minifors s pracovním objemem 3,3 litru se pohybuje v rozmezí 500 - 600 tis. Kč, což je obdobná cena jako třepačka Multitron Pro s chlazením.